如何進(jìn)一步提高數(shù)字PCR檢測低頻突變的靈敏度？

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時間: 2025-06-25 | 34 次瀏覽 | 分享到:

數(shù)字PCR定量分析技術(shù)是通過將DNA分子分配到獨(dú)立的反應(yīng)室，并在每個反應(yīng)室中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，對陽性熒光信號進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)DNA分子的定量。數(shù)字PCR技術(shù)擺脫了對標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴，具有更高靈敏度和準(zhǔn)確度，是繼實(shí)時定量PCR之后新興發(fā)展起來的一種絕對定量分析技術(shù)。在基因突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、微生物檢測等方面有著廣泛應(yīng)用前景。

理想狀況下，ddPCR（Droplet digital PCR）可檢測到0.01%的突變。以Bio-Rad QX200數(shù)字PCR為例，理論情況下可生成20,000個微滴，當(dāng)突變頻率＜0.01%時，理論上陽性微滴可能只有0-2個，統(tǒng)計的不確定性極大?？紤]增加液滴數(shù)量，在數(shù)學(xué)上是可行的，但設(shè)備復(fù)雜度和成本都可能隨之增加。因此如何進(jìn)一步提高數(shù)字PCR檢測低頻突變的靈敏度是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和液體活檢領(lǐng)域的重要研究方向。以下介紹幾種可行的方法。

加大DNA上樣量

游離DNA（cfDNA，包括循環(huán)腫瘤DNA ctDNA）的濃度是影響數(shù)字PCR檢測靈敏度的關(guān)鍵因素之一。首先可增加血漿輸入量（如 4–10 mL血漿），對于超低濃度樣本（如早期癌癥），可嘗試多管合并提取以提高檢出率。其次對于已抽提好的低濃度cfDNA我們可以采取濃縮方式提高樣本濃度，從而提高上樣量。濃縮的方式有多種，比如用純化試劑盒重新純化后減少洗脫體積，也可以使用濃縮儀直接濃縮，但濃縮方式對于樣本濃度的提升是有限的。同時要注意的是，純化試劑盒可能會造成目標(biāo)模板的丟失，濃縮儀會使樣本整體的純度變差，因此無限制的濃縮反而會造成后續(xù)PCR擴(kuò)增抑制，進(jìn)而影響低頻檢測。

圖1：濃縮前T790M檢測結(jié)果

（濃度0.776ng/ul，最大體積上樣，只檢測到1個陽性微滴）

圖2：濃縮后T790M檢測結(jié)果

（同一個樣本濃縮后濃度1.29ng/ul，最大體積上樣，可檢測到2個陽性微滴）

引入鎖核酸探針（LNA）

鎖核酸探針（Locked Nucleic Acid, LNA）是一種通過化學(xué)修飾的核酸類似物，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予其在分子檢測中顯著的優(yōu)勢，尤其在提高靈敏度、特異性和穩(wěn)定性方面表現(xiàn)突出。LNA探針可顯著擴(kuò)大完全匹配與錯配序列的Tm值差異（ΔTm >15℃），精準(zhǔn)識別SNP（單核苷酸多態(tài)性）和低頻突變（如腫瘤cfDNA 、ctDNA中的0.01%突變）。在qPCR或數(shù)字PCR中，LNA探針的非特異性結(jié)合減少，信噪比提高。故在檢測體系中引入LNA探針可在一定程度上提高低頻突變的檢出。

圖3：EGFR基因L861R突變（0.5%）不加LNA修飾的檢測結(jié)果（僅突變）

圖4：同一樣本L861R突變（0.5%）增加LNA修飾的檢測結(jié)果（僅突變）

使用預(yù)擴(kuò)或靶向富集技術(shù)

通過富集模板即在線性范圍內(nèi)同比例富集突變和野生型，用富集模板做ddPCR，從而避免了由于樣本中的DNA片段的含量過低，低于數(shù)字PCR最低檢測水平，從而造成假陰性的檢測結(jié)果。

圖5：cfDNA樣本未預(yù)擴(kuò)T790M檢測結(jié)果

圖6：同一cfDNA樣本預(yù)擴(kuò)后T790M檢測結(jié)果

多反應(yīng)孔疊加（merge）分析

通常情況下，數(shù)字PCR的單孔反應(yīng)總體系一般在20uL，單孔生成的微滴總數(shù)介于10000-20000之間，限制了單個孔的檢測樣本總拷貝數(shù)在10萬拷貝以內(nèi)（可根據(jù)基因組大小與樣本總質(zhì)量換算）。面對十萬分之一以下的低頻突變的檢測（那么意味著待測樣本的總質(zhì)量超出了單孔檢測的上限），除了上述提到的方法，可采取的另外一種檢測和分析策略是將待測樣本均分成幾個等份（保證每孔樣本投入量不超過單孔上限），分成幾個反應(yīng)孔同時進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，最終將同一樣本對應(yīng)的反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)疊加查看，也可以得到更低豐度的突變檢出。

圖7：T790M位點(diǎn)0.005%突變頻率分四孔檢測

圖8：上述四個反應(yīng)孔疊加后查看結(jié)果

其他

除了上述四種方法外，還有減少背景干擾，例如選擇性去除野生型DNA、CRISPR-Cas9 靶向切割野生型DNA、利用sgDNase（一種精準(zhǔn)的DNA分子剪切工具）特異性去除基因組中的高背景野生型鏈等方法。但此類方案通常處理復(fù)雜且成本較高，不利于常規(guī)使用。

提高低頻檢出，本質(zhì)上就是提高低豐度樣本的擴(kuò)增效率，跟聚合酶的擴(kuò)增效率、引物探針的擴(kuò)增效率（在保證特異性的前提下）、檢測樣本的純度和上樣總量都相關(guān)。沒有完美和一勞永逸的方案，在充分考慮可操作性、成本等多種因素的前提下，希望能為大家目前遇到的實(shí)驗(yàn)困境帶了一些靈感。后續(xù)會持續(xù)推出我們在實(shí)踐過程中的一些感悟心得，歡迎大家批評指正。綜上，盡管數(shù)字PCR在檢測低頻突變方面還有提升的空間，但目前仍是液體活檢中認(rèn)可度最高的技術(shù)手段之一。

ddPCR

數(shù)字PCR項(xiàng)目開發(fā)及服務(wù)

柏創(chuàng)翌生物配備了國際一流的數(shù)字PCR技術(shù)平臺：Bio-Rad微滴式數(shù)字PCR（QX200、QX600），且團(tuán)隊(duì)具有近十年的數(shù)字PCR項(xiàng)目開發(fā)及檢測服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，歡迎咨詢合作！

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