Western Blot——樣品制備篇

樣品制備的目的是從細(xì)胞或其他樣品中提取和溶解蛋白，去除污染物并將總蛋白濃度調(diào)節(jié)至合適的上樣范圍，主要涉及以下步驟和操作：

細(xì)胞裂解是指蛋白釋放到溶液中的過(guò)程。不同的生物材料，從不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離蛋白，需要不同的裂解方法。應(yīng)使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)抑制劑并控制溫度，最大限度地降低蛋白酶和其他降解或修飾蛋白的酶活性。

要想成功的進(jìn)行PAGE電泳，必須首先將蛋白溶解到緩沖體系中?？墒褂煤凶冃詣?、去污劑、還原劑、緩沖劑以及電泳體系兼容的增溶溶液。通過(guò)加入抑制劑并保持樣品低溫，防止蛋白被降解或修飾。

上樣前，需要通過(guò)蛋白測(cè)定法確定樣品中蛋白質(zhì)的濃度，調(diào)整濃度以進(jìn)行電泳分離。過(guò)高的上樣量會(huì)導(dǎo)致凝膠過(guò)載，過(guò)低的上樣量會(huì)導(dǎo)致條帶信號(hào)過(guò)弱。

在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，我們常常遇到不同類型樣品需要進(jìn)行蛋白的釋放，如培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、組織、酵母、細(xì)菌等。下面，我們介紹幾種常見(jiàn)的細(xì)胞裂解方法。

除垢劑劑可以溶解易破裂的細(xì)胞，如血細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞。NP-40等非離子型除垢劑溫和且不變性，但溶解疏水蛋白能力較低。兩性離子除垢劑(如CHAPS)和離子除垢劑(如SDS)可有效增加蛋白溶解性，并使蛋白變性。

使用勻漿器、超聲波儀或組織研磨使細(xì)胞受力破碎。超聲處理等方法會(huì)產(chǎn)生熱量，從而使樣品過(guò)熱，因此，需使用冷卻方法以避免樣品過(guò)熱。例如，在超聲處理期間，可將樣品浸入冰??；使用研缽和研杵研磨樣品時(shí)，需添加液氮保持樣品低溫。通常會(huì)同時(shí)使用化學(xué)破碎法和機(jī)械法來(lái)最大限度釋放樣品中的蛋白質(zhì)。

使用可消化植物或細(xì)菌細(xì)胞壁的酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解處理。例如，纖維素酶和果膠酶(植物細(xì)胞)、裂解酶(酵母細(xì)胞)溶菌酶(細(xì)菌)。酶處理之后通常會(huì)再使用另一種破碎方法繼續(xù)處理，如超聲。

小技巧：無(wú)論采用何種細(xì)胞破碎方法，均應(yīng)除去所有不溶物，以免堵塞凝膠孔洞，上樣前離心（15℃下20000xg，持續(xù)15分鐘）。